Eläin- ja kasvirasvojen rasvahappokoostumuksen kvalitatiivinen GC-analyysi

Tässä nopeassa menetelmässä rasvassa olevat rasvahapot transesteröidään metyyliestereiksi kaliumhydroksidin metanoliliuoksessa välivaiheessa ennen saippuointia. Muodostuneet metyyliesterit uutetaan heptaaniin. Heptaanifraktiosta tehdään kvalitatiivinen ja puolikvantitatiivinen GC-analyysi käyttäen vertailuna tunnettuja metyyliestereitä.

Kuva1: Triglyseridin rakenne

Reagenssit

• Metanolia, jossa enintään 0,5 % vettä
• Heptaania kromatografiaa varten, vähintään p.a -laatu
• Kaliumhydroksidin n. 2 M metanoliliuos, joka saadaan liuottamalla 11,2 g KOH 100 ml:n metanolia
• Vertailustandardi
  Valmista kaupallisista rasvahappojen metyyliestereistä seosstandardi liuottamalla niitä muutama mg 2 ml heptaania; esim. metyylistearaatti (C 18:0), metyylilinoleaatti (C 18:2), metyyliarakidaatti (C 20:0).
  

Välineistö

• Kierrekorkillisia koeputkia (tilavuus 5 ml), joiden korkissa PTFE-liitos
• Mitta- tai automaattipipetit, 2 ja 0,2 ml
• Kaasukromatografi, FID-detektori
  

Näytteen valmistus
Valmista näyte esim. oliivi- rypsi- tai camelina-öljystä. Myös soxhlet -raakarasva-uutossa saadusta rasvasta voi tehdä tällä tekniikalla GC-analyysin.
Mittaa 5 ml:n kierrekorkilliseen koeputkeen noin 0,1 g näyteöljyä tai rasvaa. Lisää 2 ml heptaania ja ravistele. Lisää 0,2 ml kaliumhydroksidin 2 M metanoliliuosta, sulje tiiviisti PTFE-liitoksella varustetulla korkilla, ravistele voimakkaasti 20 sekuntia. Anna putken seistä, kunnes liuoksen pintakerros kirkastuu. Erota pintakerros, jossa metyyliesterit ovat. Heptaaniliuos voidaan injektoida kromatografiin. Liuos on syytä säilyttää jääkaapissa, kunnes se määritetään kromatografilla. Liuosta ei suositella säilytettäväksi yli 12 tuntia.

Kaasukromatografia Ajo-olosuhteet:
Kolonni	Polaarinen kapillaarikolonni esim. NB-351 (max 260 °C)
Kantokaasu	He, 2 ml/min
Split	1:50 - 1:80
Injektori	200 °C
Detektori	270 °C
Kolonnin uuniohjelma	100 °C, 0 min 8 °C/min 240 °C, 3 min
Injisointitilavuus	0,5 µl - 1 µl
Attenuaattori	käytä sopivaa vaimennosta

Kolonnin esivalmistelu
Kolonni esilämmitetään päivittäin ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee 3 °C minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 °C alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on stabiloitunut.

GC-määritys
Ime 10 µl:n mikroruiskuun 1µl heptaania, sitten 0,5 µl ilmaa ja tämän jälkeen
0,5 µl - 1 µl vertailuainetta; lopuksi männällä vedetään neula tyhjäksi (näyte sylinteriosaan). Neula työnnetään septumin läpi injektoriin ja 1-2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti.
Injektoi vertailunäytettä, jossa tunnettuja metyyliestereitä. Injektoi sitten näytteet samalla tavalla 2-3 kertaa rinnakkaismäärityksinä.

Tulokset
Kvalitatiivinen tulkinta
Näytteen rasvahappojen retentioaikoja verrataan vertailuaineen tunnettujen rasvahappojen retentioaikoihin ja päätellään niiden ja happojen hiiliatomien lukumäärän perusteella rasvahappojen sijainti kromatogrammissa.

Pääkomponenttien prosenttiosuuden laskeminen; puolikvantitatiivinen analyysi
Rasvahappokoostumuksen laskemiseksi on kokonaispinta-alaan otettava huomioon tärkeimpien rasvahappojen pinta-alat: myristiinihappo (C14:0), palmitiinihappo (C16:0), steariinihappo (C18:0), öljyhappo eli oleiinihappo (C18:1), linolihappo (C18:2), arakidiinihappo (C20:0), eikosaeenihappo (C20:1), linoleenihappo (C18:3), beheenihappo (C22:0) ja lignoseriinihappo (C24:0)

Kunkin rasvahapon prosenttiosuus lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti:

Kuva2: Oliiviöljyn (päärasvahappo öljyhappo) GC-grammi

Etusivu > Analyysiohjeet > Rasvahappojen GC-analyysi