Veden koliformisten bakteerien kokonaismäärän määritys kalvosuodatusmenetelmällä

Määritelmät
Koliformiset bakteerit tarkoittaa ryhmää fakultatiivisesti anaerobisia, itiöitä muodostamattomia sauvabakteereja, gram-negatiivisia sauvabakteereja, oksidaasi-negatiivisia, jotka käyttävät laktoosia tuottaen happoa, kaasua ja aldehydiä 48 tunnissa, kun lämpötila on 35 °C tai 37 °C.
Lämpökestoiset koliformiset bakteerit tarkoittaa bakteereita, jotka tuottavat kaasua ja happoa myös lämpötilassa 44,5 °C 24 tunnissa.

Periaate
Kalvosuodatusta käyttäen bakteerit saadaan kerätyksi vesinäytteestä kalvolle. Kalvo asetetaan koliformisia bakteereja suosivalle kasvualustalle. Kasvualusta ei täysin ehkäise vieraiden organismien kasvua. Alustassa on pelkistynyttä fuksiinia laktoosista aldehydiä muodostavien koliformisten bakteeripesäkkeiden erottamiseksi muista pesäkkeistä.

Laitteet ja välineet

• Lasitavarat
  Lasitavarat pestään synteettisellä pesuaineella ja kuumalla vedellä, huuhdellaan 6 – 12 kertaa kuumalla vedellä ja lopuksi puhtaalla vedellä. Lasitavarat steriloidaan 1h 170 °C.
• Näyte- ja laimennusvesipullot
  Lasi- tai muusta sopivasta materiaalista valmistetut pullot steriloidaan. Jos pullossa on hioskorkki, korkki suojataan foliolla.
• Pipetit
  Pipettien tulee tyhjentyä nopeasti ja niin tarkasti, että pipetin virhe ei ylitä 2,5% ja tilavuusmerkintöjen tulee olla selvät. Pipetit steriloidaan kuumailmakaapissa astiassa, joka ei sisällä kuparia.
• Petrimaljat
  Lasimaljat steriloidaan kuumailmakaapissa. Muovimaljat myydään steriileinä.
• Suodatinlaite
  Suodatinlaitteisto koostuu:
     1. saumaton suppilo, jossa on suodatinta kannattava tukeva huokoinen kalvo
     2. imupullo
     3. vesisuihkupullo
  Suodatinlaite steriloidaan autoklavoimalla. Suppilo voidaan steriloida myös polttamalla etanolia 20 – 30 s suppilossa.
• Suodatinkalvot
  Suodatinkalvot voidaan steriloida autoklaavissa 10 min 121°C. Valmiiksi steriloituja kalvoja on saatavilla kaupallisesti.
• Pyöreäkärkiset pinsetit
• Kuumailmakaappi vähintään 170 °C.
• Lämpökaappi inkobointia varten 35 ± 0,5 °C tai 37 ± 0,5 °C.
  Kasvatuskaappiin asetetaan vesiastia riittävän kosteuden ylläpitämiseksi. Jos kasvatuskaappiin ei saada sellaista kosteutta, että maljoista ei haihdu vettä, asetetaan maljat muovipusseihin.
• Autoklaavi sterilointia varten
• Pesäkelaskulaitteisto

Kasvualusta ja laimennusvesi
Reagensseina käytetään analyysipuhdasta laatua. Puhdistetun veden sähkönjohtavuuden on oltava < 0,1 µS/cm eikä siinä saa olla yli 45 µm läpimittaisia hiukkasia ja kuparipitoisuuden tulee olla alle 10 µg/l.

Kasvualusta

• hiivauute 1,2 g
• kasitoni tai tryptikaani 3,7 g
• tiopeptoni tai tiotoni 3,7 g
• tryptoosi 7,5 g
• laktoosi 9,4 g
• dikaliumvetyfosfaatti, K₂HPO₄ 3,3 g
• kaliumdivetyfosfaatti, KH₂ PO₄ 1,0 g
• natriumkloridi, NaCl 3,7 g
• natriumdeoksikolaatti 0,1 g
• natriumlauryylisulfaatti, C₁₂H₂₅OSO₃ Na 0,05 g
• natriumsulfiitti Na₂SO₃ 1,6 g
• emäksinen fuksiini 0,8 g
• puhdistettu vesi, jossa on 20 ml 96% etanolia 1000 ml

Kasvualustan valmistus
Reagenssit liuotetaan puhdistettuun veteen, , jossa on 20 ml 96% etanolia ja kuumennetaan kiehuvaksi. Alusta jäähdytetään 45 – 50 °C. Alustaa ei autoklavoida. Kasvualusta valetaan steriileille maljoille vähintään 3 mm kerrokseksi ja jäähdytetään tasolla. Kasvualusta tummuu auringonsäteilyn vaikutuksesta. Maljat säilyvät 2 – 10 °C ja pimeässä enintään kaksi viikkoa elleivät ne pääse kuivumaan. Pitkään säilytetyissä kasvualustoissa voi sulfiitti hapettua, jolloin alusta on tummanpunainen. Alustaan voidaan lisätä muutama pisara (1 ml/l) vastavalmistettua natriumsulfiittiliuosta ja kuumentaa kiehuvaksi.

Laimennusvesi
990 ml puhdistettua vettä tai 990 ml 10 g/l NaCl liuosta lisätään 1 ml kaliumdivetyfosfaatin kantaliuosta, 5 ml magnesiumsulfaattiliuosta ja 1 ml natriumhydroksidiliuosta ja täytetään litraksi. Steriloidaan autoklaavilla 15 min 120 °C.

Näyte
Näyte otetaan työohjeen vesinäytteenotto mikrobiologisessa tutkimuksessa mukaan.

Suoritus
Kalvo steriloidaan keitetyssä vedessä muutama minuutin ajan. Pinsetit steriloidaan kastamalla ne etanoliin ja sytyttämällä pinsetteihin jäänyt alkoholi tuleen. Steriloitu kalvo siirretään steriloiduilla pinseteillä steriloidun suodatinlaitteen huokoiselle levylle. Suodatinlaite ja kalvo jäähdytetään suodattamalla steriiliä vettä. Näyte sekoitetaan ravistamalla pulloa 25 kertaa. Edullisin pesäkemäärä on halkaisijaltaan 45 mm kalvolla noin 100 kappaletta. Jos näytettä laimennetaan tehdään siitä eksponentiaalinen laimennussarja 1/10 (10 ml näytettä 90 ml laimennusvettä) tai 1/100 (1 ml näytettä 99 ml laimennusvettä). Suodatinkalvo siirretään kasvatusalustalle ja maljoja inkuboidaan 35 ± 0,5 °C tai 37 ± 0,5 °C 42 ± 3 tuntia.

Pesäkkeiden laskeminen
kasvatuksen jälkeen lasketaan tummanpunaiset, metallinkiiltoiset, selvästi kohollaan olevat pesäkkeet. Luotettavimmin metallinkiillon havaitsee luonnonvalossa. Kalvoilla voi esiintyä näytteestä riippuen runsaasti taustakasvua.

Tulokset
Tulokset ilmoitetaan 100 ml kohti. Tulokset ovat luotettavimmillaan, kun koliformisia pesäkkeitä on 20 – 80 kappaletta. Tarkkuus heikkenee pesäkeluvun pienentyessä. Kun pesäkkeiden lukumäärä ylittää 80, pesäkkeiden väliset vuorovaikutukset aiheuttavat sen, että tulosten luotettavuus kärsii.

Puhdasviljelmät
Koliformisten bakteerien muodostamat pesäkkeet eristämällä kaikki ja arpomalla vähintään 10, mieluummin 30 – 50 pesäkettä puhdasviljelmäksi tryptoni-hiivauute-alustalle. Puhdasviljelmistä tehdään gram-värjäys, oksidaasikoe ja kaasunmuodostus laktonista 35 ± 0,5 °C tai 37 ± 0,5 °C ja 48 tunnin kasvatuksen kuluttua.
Kannat, jotka ovat gram-negatiivisia, oksidaasinegatiivisia ja tuottavat laktoosista kaasua, ovat koliformisia bakteereja.

Etusivu > Ympäristöanalyysit > Koliformiset bakteerit

Raportointi-
kaavake
(33 kt Word)