Palaute
Sivukartta

Etusivu > Analyysimenetelmät > 2.6. Nestekromatografia
  		Edellinen | Seuraava

2.6. Nestekromatografia
Peruskäsitteet
Periaate
Nestekromatografiakolonnissa liikkuvana faasina on neste ja stationaarifaasina kiinteä faasi tai siihen sidottu neste.

Sovellukset
Käytetään laajasti haihtumattomien orgaanisten yhdisteiden tutkimuksessa. Arvion mukaan vain noin 20 %:a tunnetuista orgaanisista yhdisteistä on haihtuvia. HPLC:n edellytyksenä on, että erotettavat yhdisteet liukenevat johonkin liuottimeen tai liuotinseokseen, jonka laitteisto kestää.

Määritysraja
Menetelmällä voidaan analysoida yhdisteitä ng-, pg- ja fg-tasolla.

Rajoitukset
Aineiden erottuminen kolonnissa riippuu monista tekijöistä. Yleisimmin käytetyt detektorit eivät ole selektiivisiä.

Nestekromatografia

Nestekromatografisessa (LC, liquid chromatography) erotuksessa näytekomponenteilla on aktiivinen vuorovaikutus sekä liikkuvan että stationaarifaasin kanssa. Nestekromatografia jaetaan useaan ryhmään stationaarifaasin mukaisesti ja edelleen erotusmekanisminsa mukaisesti. Korkean erotuskyvyn (tai suorituskyvyn) nestekromatografia (HPLC, high performance liquid chromatography) käyttää korkeata painetta pakottaakseen ajoliuoksen eli eluentin kulkemaan hyvin hienojakoisilla jauheilla pakattujen kolonnien läpi. Nestekromatografiassa käytetään lähes yksinomaan pakattuja kolonneja. Ne on tehty yleensä ruostumattomasta teräksestä tai teräsputkeen asetettavasta lasiputkesta, joka on pakattu sopivalla stationaarifaasilla.

analyysimenetelmat_2-6_kuva1.gif
Kuva 1. Nestekromatografialaitteistossa näytteen syöttö tapahtuu näytteensyöttöventtiilin avulla. Silmukka täytetään näyteliuoksella ja pumppu työntää silmukan sisällön kolonniin.

Normaalifaasinestekromatografia
Kun paikallaan pysyvä eli stationaarifaasi on poolisempi kuin liikkuva faasi, puhutaan normaalifaasinestekromatografiasta (NP-HPLC, normal phase high performance liquid chromatography). Normaalifaasinestekromatografiassa kolonnimateriaali on yleensä silika, jonka lisäksi käytetään alumiinioksidia ja erilaisia poolisia sidottuja faaseja (syano-, amino-, dioli- ja nitrofaasi). Liikkuvana faasina käytetään orgaanisten liuottimien seoksia, jotka sisältävät yhtenä komponenttina yleensä heksaania ja toisena asetonia, dikloorimetaania, etyyliasetaattia, asetonitriiliä, metanolia, etanolia tai 2-propanolia. Poolittomat yhdisteet eluoituvat kolonnista ennen poolisia yhdisteitä. Normaalifaasinestekromatografia soveltuu myös ionisten ja ionisoituvien yhdisteiden analytiikkaan. Enimmäkseen sitä käytetään kuitenkin neutraalien eli varauksettomien yhdisteiden analysoinnissa. Normaalifaasinestekromatografia ei ole yhtä yleisesti käytössä kuin nykyisin usein käytetty käänteisfaasinestekromatografia.

Käänteisfaasinestekromatografia
Kun liikkuva faasi on poolisempi kuin stationaarifaasi, puhutaan käänteisfaasinestekromatografiasta (NP-HPLC, reverse phase liquid chromatography). Tällöin pooliset yhdisteet eluoituvat nopeammin. Valtaosa HPLC-analyyseistä tehdään tällä tekniikalla. Liikkuvana faasina on tavallisesti veden ja jonkin vesiliukoisen orgaanisen liuottimen kuten metanolin, asetonitriilin tai tetrahydrofuraanin seos. Yleisimmin käytetyt stationaarifaasit ovat C18-, C8-, C2- ja fenyylifaasit, joissa hiilivetyketjut on sidottu silikaan. Nämä stationaarifaasit ovat hyvin stabiileja pH-alueella 2 - 8.

Detektorit
Yleisimmin käytettyjä detektoreja ovat UV-, UV-VIS-, fluoresenssi-, sähkökemialliset ja taitekerroindetektorit (RI, refraction index). Taitekerroin detektori on huomattavasti epäherkempi kuin UV-detektori ja lisäksi se on herkkää kromatografisen ajon aikana tapahtuville lämpötilan vaihteluille. Massaspektrometriaa käytetään nykyään paljon nestekromatografin detektorina.

Taulukko 1. Nestekromatografialaitteistossa yleisimmin käytettyjen detektorien ominaisuuksia
Detektori Sovellusalue Lineaarinen alue Gradienttiajo
Taitekerroindetektori hyvin laaja 104 ei sovellu
Johtokykydetektorit suppea 105 huono
UV/VIS laaja 105 hyvä
Fluoresenssi rajattu 104 hyvä
Amperometriset detektorit rajattu 106 huono
Kulometriset detektorit rajattu 106 huono
Johtokykydetektorit rajattu 105 huono
Massaspektrometri laaja hyvin suuri hyvä

Lisätietoa Internetistä
http://kerouac.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/hplcmytry.html
http://www.separationsnow.com/basehtml/SepH/1,1353,3-0-0-0-0-home-0-0,00.html
http://www.forumsci.co.il/HPLC/index.html
http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm#Introduction

Kirjallisuus
  1. Harris, D.H. 2002: Quantitative chemical analysis. 6. painos. W.H. Freeman and company, New York.
  2. Jeffery, G.H., Bassett, J., Mendham, J. & Denney, R.C. 1989: Vogel’s textbook of quantitative chemical analysis. 5. painos. Longman Scientific & Technical, London.
  3. Kenkel, J. 2003: Analytical chemistry for technicians. 3. painos. Lewis publishers, A CRC Press Company, New York.
  4. Laukkanen, R., Nykänen R. Ja Vuokila, O. 1987: Analyysit. Ammattikasvatushallitus, Valtion painatuskeskus, Helsinki.
  5. Lehtonen, P. ja Sihvonen, M-L.; Laboratorioalan analyyttinen kemia, Opetushallitus, Edita Prima Oy, Helsinki, 2004.
  6. Riekkola, M-L. ja Hyötyläinen, T., Kolonnikromatografia ja kapillaarielektromigraatiotekniikat, Yliopistopaino, Helsinki, 2000.

Etusivu > Analyysimenetelmät > 2.6. Nestekromatografia 		Edellinen | Seuraava