Säilöntäaineiden määritys nestekromatografilla

Etusivu > Elintarvikeanalyysit > Lisäaineet, säilöntäaineet Etusivu > Analyysiohjeet > Nestekromatografia, HPLC - säilöntäaineiden määritys
Säilöntäaineiden määritys nestekromatografilla
Yleistä Useat elintarvikkeet sisältävät säilöntäaineita, joilla tuotteiden mikrobiologista säilymistä on haluttu parantaa. Elintarvikelainsäädännön lisäaineasetuksessa säädetään kuinka paljon säilöntäaineita saa käyttää. Nestekromatografisilla menetelmillä voidaan mitata säilöntäaineiden lisäksi suuri määrä orgaanisia yhdisteitä. Jos yhdiste voidaan liuottaa johonkin liuottimeen, voidaan nestekromatografiaa todennäköisesti käyttää sen määritykseen. Nestekromatografialaitteiston pääosat ovat ajoliuos eli eluentti, pumppu, injektori, kolonni, detektori ja tulostusyksikkö. (Liite 1) Yhdisteiden määritys on nopeaa. Yhdisteet tunnistetaan standardeja vastaavista retentioajoista (viipymisajoista) ja yhdisteiden pitoisuudet lasketaan standardien pitoisuuksien avulla. Työn tavoite Työssä tutustutaan nestekromatografialaitteistoon ja sen käyttöön. Työn tarkoituksena on määrittää mehun/hillon/virvoitusjuoman säilöntäainepitoisuudet (sorbiinihappo- ja bentsoehappopitoisuudet ) nestekromatografisesti. Reagenssit ja välineet - Ioniton vesi (ionivaihdettu vesi) - Metanoli, CH₃OH, HPLC-laatu - Natriumasetaatti, CH₃COONa, p.a - Jääetikka, CH₃COOH (tai suolahappo, HCl) - Natriumbentsoaatti , C₆H₅COONa, p.a - Kaliumsorbaatti , C₆H₇KO₂, p.a Laitteet - Nestekromatografi - C-18 pooliton käänteisfaasikolonni - UV-detektori, λ = 254 nm - Ultraäänihaude Periaate Näyte on käsiteltävä ennen nestekromatografia-ajoa. Se valmistetaan liuosmuotoon. Retentioaikojen eli viipymäaikojen avulla pystytään yhdisteet tunnistamaan. Yhdisteiden pitoisuudet määritetään kvantitatiivisesti ulkoisen tai sisäisen standardin menetelmällä. Tässä työssä käytetään ulkoisen standardin menetelmää. Näytteet uutetaan vedellä ja metanolilla. Ennen nestekromatografia-ajoja näytteet ja standardit suodatetaan ja ilmastetaan. Yhdisteiden erottuminen tehdään C-18 käänteisfaasikolonnissa. Käänteisfaasitekniikassa eluenttina toimii polaarinen liuotin ja kolonnimateriaalina pooliton hiilivety. Työssä yhdisteiden detektointiin käytetään UV-detektoria 254 nm aallonpituutta. Työn suoritus Eluentin valmistus: Eluenttina käytetään metanoli-ammoniumasetaattiseosta. 300 ml metanolia laimennetaan litraksi 0,1 molaarisella natriumasetaatilla. Eluentin pH säädetään arvoon 4,7-4,8 jääetikalla (tai suolahapolla). Standardien valmistus: Valmistetaan bentsoehaposta ja sorbiinihaposta 1000 mg/l liuokset. Happomuodot liukenevat heikosti veteen, joten perusliuokset tehdään suoloista, natriumbentsoaatista ja kaliumsorbaatista. 1180 mg natriumbentsoaattia vastaa 1000 mg bentsoehappoa ja 1340 mg kaliumsorbaattia vastaa 1000 mg sorbiinihappoa. Suhdeluvut lasketaan moolimassojen suhteiden perusteella. Perusliuoksista laimennetaan 100 mg/l välilaimennukset ja samoihin mittapulloihin valmistetaan bentsoehaposta ja sorbiinihaposta 1,5,10,15,20 mg/l standardit. Laimennuslaskut lasketaan kaavalla c1V1 = c2 V2, jossa c1 = perusliuoksen pitoisuus, mg/l V1 = perusliuoksen tilavuus, ml c2 = laimennuksen pitoisuus, mg/l V2 = laimennuksen tilavuus, ml Molemmista yhdisteistä tehdään oma tunnistestandardi, jonka retentioajan perusteella yhdiste tunnistetaan näytteestä ja standardeista. 5 mg/l:n tunnisteliuokset tehdään 1000 mg/l perusliuoksesta. Näytteen valmistus: Kiinteät näytteet homogenisoidaan ja punnitaan. Virvoitusjuomista poistetaan hiilidioksidi ultraäänihauteella. Siirretään 5 g / 5 ml näytettä 100 ml mittapulloon. Lisätään 30 ml vettä ja ravistellaan voimakkaasti. Lisätään 60 ml metanoli, ravistellaan ja jäähdytetään huoneenlämpöiseksi, jonka jälkeen täytetään merkkiin metanolilla. Tee rinnakkaisnäytteet. Suodata ensin suodatinpaperilla ja sen jälkeen 0,45 µm suodattimen läpi. Ajo-olosuhteet: Kolonni : Käänteisfaasikolonni Novapak C - 18 Detektori : UV-detektori, 254 nm Virtausnopeus : 1,0 ml/min Injektointi : 20 µl Eluentti : 0,1 M Natriumasetaatti-metanoliliuos pH 4,7-4,8 Eluentin ajo-olosuhteet : A 70 % (Na-asetaatti) B 30 % (Metanoli) Yhdellä pumpulla ajettaessa eluentin koostumus säilyy vakiona. Tuloksen laskeminen ja tulkinta Ensin tutkitaan orgaanisten happojen retentioajat tunnistestandardien perusteella. Piirrä bentsoehapolle ja sorbiinihapolle omat standardisuorat, jossa x-akselilla on säilöntäaineen pitoisuus, ppm ja y-akselilla piikkien pinta-ala. Piikkien pinta-ala on helpoin laskea piirtämällä piikistä kolmio ja laskemalla kolmion pinta-ala. (liite 2) Näytteen piikin pinta-ala lasketaan vastaavasti ja suoralta katsotaan laimennetun näytteen bentsoehappo- tai sorbiinihappopitoisuus. Lopuksi lasketaan alkuperäisen näytteen säilöntäainepitoisuudet huomioimalla laimennukset. Työturvallisuus Työ tehdään hyvin ilmastoidussa tilassa, varottava metanolin joutumista silmiin. Jätteiden käsittely Metanoli on ongelmajäte, joten sitä sisältävät liuokset hävitetään paikallisen jätehuoltoviranomaisen ohjeen mukaisesti tai toimitetaan ongelmajätelaitokselle. Lähteet Jaarinen Soile, Niiranen Jukka, 1996, Laboratorion analyysitekniikka, Edita, Helsinki http://www.elintarvikevirasto.fi/ http://www.tut.fi/units/ymp/bio/board/laakeaineen_maaritys.pdf http://kerouac.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/hplcmytry.html Liitteet Liite 1. Nestekromatografilaitteisto Liite 2. Standardisuoran piirtäminen ja piikkien pinta-alan laskeminen Piikkien pinta-alat lasketaan kolmion pinta-alana. Kolmion kanta saadaan tangenttien mukaan ja piikin korkeus mittaamalla piikin huippu. Standardisuora piirretään seuraavasti	Mittaus- pöytäkirja (46 kt Word) Raportointi- kaavake (33 kt Word)
Etusivu > Elintarvikeanalyysit > Lisäaineet, säilöntäaineet Etusivu > Analyysiohjeet > Nestekromatografia, HPLC - säilöntäaineiden määritys