Palaute
Sivukartta

Etusivu > Elintarvikeanalyysit & Analyysiohjeet > Nestekromatografia, HPLC - kofeiinin määritys
 

 Kofeiinin nestekromatografinen määritys
Yleistä
Kofeiini on valkoista, kiteistä ainetta, jonka kidevedettömän muodon sulamispiste on 238 °C. Kahvipapujen kofeiinipitoisuus vaihtelee eri kahvipensaslaatujen välillä. Kofeiinia on myös kaakaopavuissa ja siten kaakaossa ja suklaatuotteissa. Myös tee sisältää kofeiinia. Kahvikupillisessa on kofeiinia keskimäärin 75 mg riippuen tietysti kupin koosta, valmistustavasta ja siitä kuinka vahvaa kahvista tehdään. Yleensä pikakahvista tehdyssä kupillisessa on kofeiinia vähemmän (noin 65 mg) ja suodatinkahvissa taas enemmän (noin 110 mg). Teekupillisessa on kofeiinia noin 30 mg, mutta siinäkin vaihtelu on suurta.

Työn tavoite
Työssä tutustutaan nestekromatografialaitteistoon. Työn tarkoituksena on määrittää kahvin tai teen kofeiini nestekromatografisesti.
 
Reagenssit ja välineet
- Metanoli, CH3OH, HPLC-laatu
- Ioniton vesi (ionivaihdettu vesi)
- Ortofosforihappo H3PO4, p.a
- Kofeiini, p.a 		Laitteet
- Nestekromatografi
- C-18 pooliton käänteisfaasikolonni
- Uv-detektori, λ = 273 nm
- Ultraäänihaude

Periaate
Kahvi tai teenäyte liuotetaan metanoliin. Tästä liuoksesta määritetään kofeiini nestekromatografisesti käänteisfaasikolonnilla ja UV-ilmaisimella. Tässä työssä käytetään ulkoisen standardin menetelmää. Näytteet uutetaan vedellä ja metanolilla. Ennen nestekromatografia-ajoja näytteet ja standardit suodatetaan ja ilmastetaan. Yhdisteiden erottuminen tehdään C-18 käänteisfaasikolonnissa. Käänteisfaasitekniikassa eluenttina toimii polaarinen liuotin ja kolonnimateriaalina pooliton hiilivety. Työssä yhdisteiden detektointiin käytetään UV-detektoria 273 nm aallonpituutta.

Työn suoritus
Eluentin valmistus:
Eluenttina käytetään vesi-metanoliseosta. 600 ml vettä, jossa on 0,3 ml fosforihappoa laimennetaan litraksi metanolilla.

Standardiliuosten valmistus:

  1. Punnitse tarkasti 50 mg kofeiinia 100 ml:n mittapulloon, jossa on n. 20 ml metanolia. Anna liueta ja täytä pullo 100 ml:ksi metanolilla. Tämän kofeiinin perusliuoksen pitoisuus on 500 mg/l.
  2. Tee tästä liuoksesta seuraavat laimennokset: 1, 2, 3, 4 ja 5 mg/l. Laimennuslaskut lasketaan kaavalla:
                        c1*V1 = c2*V2, jossa
                        c1 = perusliuoksen pitoisuus, mg/l
                        V1 = perusliuoksen tilavuus, ml
                        c2 = laimennuksen pitoisuus, mg/l
                        V2 = laimennuksen tilavuus, ml
  3. Poista liuoksista ilma ultraäänihauteella sekä suodata ne 0,45 µm suodattimen läpi.

Näyteliuoksen valmistus:

  1. Pipetoi 10 ml valmista kahvi- tai teejuomaa 100 ml:n mittapulloon. Täytä 100 ml:ksi metanolilla ja sekoita hyvin. Tee rinnakkaisnäytteet.
  2. Poista liuoksista ilma ultraäänihauteella sekä suodata ne 0,45 µm suodattimen läpi.

Aja ensin standardiliuokset ja sitten valmistamasi näyte nestekromatografilla. Näyteliuoksen esikäsittelyn voi tehdä myös uuttamalla liitteen 3 ohjeen mukaan.

Ajo-olosuhteet:

  • Kolonni : C - 18 pooliton hiilivetykolonni
  • Detektori : UV-detektori, λ =273 nm
  • Virtausnopeus : 1,0 ml/min
  • Injektointi : 20 µl
    • Eluentti : A = vesi, jossa on 0,5 ml fosforihappoa / litra vettä
                   B = metanoli
  • Eluentin ajo-olosuhteet : A 60 %     B 40 %
  • Yhdellä pumpulla ajettaessa eluentin koostumus säilyy vakiona.
Tulosten laskeminen ja tulkinta
Piirrä erilliselle millimetripaperille standardisuora, jossa x-akselilla on kofeiinin pitoisuus, mg/l ja y-akselilla piikkien pinta-ala. Piikkien pinta-ala on voidaan laskea erillisellä integrointiohjelmalla tai helpoin tapa on piirtää piikistä kolmio ja laskea kolmion pinta-ala. (liite 2) Näytteen piikin pinta-ala lasketaan vastaavasti ja suoralta katsotaan laimennetun näytteen kofeiinipitoisuus. Lopuksi lasketaan alkuperäisen näytteen kofeiinipitoisuus ja laimennuskerroin.

Työturvallisuus
Työ tehdään hyvin ilmastoidussa tilassa, varottava metanolin joutumista iholle.

Jätteiden käsittely
Metanoli on ongelmajäte, joten sitä sisältävät liuokset hävitetään paikallisen jätehuoltoviranomaisen ohjeen mukaisesti tai toimitetaan ongelmajätelaitokselle.

Lähteet

Liitteet
Liite 1. Nestekromatografilaitteisto


Liite 2. Standardisuoran piirtäminen ja piikkien pinta-alan laskeminen

Piikkien pinta-alat lasketaan kolmion pinta-alana. Kolmion kanta saadaan tangenttien mukaan ja piikin korkeus mittaamalla piikin huippu.

Standardisuora piirretään seuraavasti

Liite 3. Kofeiininäytteen esikäsittely kiinteäfaasiuutolla (SPE)

Patruunan täyte on RP-18 faasia.

Näyte ruiskutetaan muoviruiskulla (5 ml) hitaasti patruunan läpi.

Patruuna on pesun jälkeen taas käyttökelpoinen.

 

Näytteen valmistus:

  1. Valmista kahvi- tai teejuoma punnitsemalla kahvijauho tunnettuun tilavuuteen. Jos käytät Cola- tai Batteryjuomaa, anna hiilihapon ensin poistua
  2. Sekoita 5 ml kahvia ja 5 ml 0.05 M NaH2PO4:a
  3. Ruiskuta SepPak-C18:n läpi 5 ml metanolia ja 10 ml 0.05 M NaH2PO4:a
  4. Ruiskuta SepPakiin 5 ml kahvi-puskuri liuosta.
  5. Ruiskuta SepPakin läpi 5 ml 0.05 M NaH2PO4:a. Nämä liuokset voi heittää pois.
  6. Eluoi kofeiini 5 ml:lla metanoli - 0.05 M NaH2PO4 (50:50) liuoksella 10 ml:n mittapulloon.
  7. Laimenna 10 ml:ksi 0.05 M NaH2PO4:lla.
  8. Suodata injektointia varten muutama ml mikrosuodattimen läpi ja injisoi 20 µl näytettä, kunnes tulokset ovat toistettavia.

Näytteen laimennuskerroin näiden vaiheiden jälkeen on 4.

 
Mittaus-
pöytäkirja
(32 kt Word)

Raportointi-
kaavake
(33 kt Word)

Etusivu > Elintarvikeanalyysit & Analyysiohjeet > Nestekromatografia, HPLC - kofeiinin määritys